蛋白降解研究思路和方案设计

生命科学研究中蛋白降解通过将多余、受损或异常的蛋白及时降解从而维持细胞稳态避免疾病发生蛋白降解调控也是生物学研究最常见的致病机制之一。那蛋白降解分子机制应该如何研究呢一、确认A蛋白调控B蛋白降解在深挖机制前必须先明确核心前提A蛋白对B蛋白的调控发生在“降解”环节而非影响其转录、翻译或定位。实验设计1在合适的细胞系中高表达或者干扰蛋白A然后通过Western blot检测蛋白B的表达变化。若过表达/敲低A蛋白表达能够调控B蛋白表达说明A蛋白可能调控B蛋白的降解。实验设计2首先在合适的细胞系中高表达或者干扰蛋白A提取总RNAqPCR检测蛋白B的mRNA表达水平然后在合适的细胞系中高表达或者干扰蛋白A然后使用环己酰亚胺CHX抑制蛋白合成处理细胞分别在0h、2h、4h、8h、12h收集细胞WB检测B蛋白的降解速率半衰期。若A蛋白过表达/敲低后B蛋白的mRNA水平无显著变化但B蛋白的半衰期明显缩短/延长说明A蛋白调控B蛋白降解而非影响mRNA合成和翻译。二、A蛋白调控B蛋白降解机制挖掘细胞内蛋白降解的核心通路主要有2种泛素-蛋白酶体系统UPS承担约80%的胞内蛋白降解任务和自噬-溶酶体途径其中UPS通路是最常见的调控机制。实验设计1在合适的细胞系中高表达或者干扰蛋白A使用不同通路的抑制剂处理细胞观察B蛋白含量变化。若加入MG132后A蛋白过表达导致的B蛋白降低被显著逆转说明A蛋白可能通过调控泛素化过程影响B蛋白降解若加入CQ后A蛋白过表达导致的B蛋白降低被逆转说明依赖自噬-溶酶体通路。1UPS通路抑制剂MG132最常用抑制蛋白酶体活性阻断泛素化蛋白降解。2自噬-溶酶体通路抑制剂Chloroquine氯喹CQ抑制溶酶体酸化阻断自噬降解、3-MA抑制自噬起始。实验设计2判断A蛋白是直接结合B蛋白调控其降解还是通过招募其他分子如E3泛素连接酶间接调控。首先在合适细胞中转染A和B蛋白通过Co-IP验证蛋白A和B的相互作用然后在合适细胞中转染A和B蛋白通过IF验证蛋白A和B的共定位。若Co-IP能检测到A蛋白与B蛋白共沉淀且IF观察到共定位说明两者存在直接相互作用若Co-IP未检测到直接结合则可能是A蛋白通过招募其他分子如E3连接酶间接调控。三、明确具体调控机制以UPS通路为例若确认A蛋白通过UPS通路调控B蛋白降解需明确A蛋白是影响B蛋白的泛素化修饰泛素连接、去泛素化还是影响泛素化B蛋白与蛋白酶体的结合。实验设计1在合适细胞中高表达/敲低A蛋白后同时高表达蛋白B和泛素Ub分子加入MG132抑制泛素化蛋白降解使泛素化产物累积处理6-12h后通过Co-IP检测蛋白B泛素化水平。A蛋白过表达后B蛋白的泛素化水平显著升高A蛋白敲低后泛素化水平显著降低说明A蛋白通过促进B蛋白的泛素化修饰加速其被蛋白酶体降解。实验设计2根据A蛋白的结构和已知功能明确A蛋白的作用角色常见有3种可能1若A蛋白为含有RING-finger、HECT等E3泛素连接酶结构域的泛素连接酶则构建A蛋白催化结构域突变体如RING结构域突变过表达该突变体检测B蛋白的泛素化水平和降解速率。2若A蛋白为含有去泛素化酶DUB结构域的去泛素化酶则过表达A蛋白野生型和DUB活性突变体检测B蛋白泛素化水平。3若A蛋白为支架蛋白招募E3泛素连接酶则通过Co-IP验证A蛋白与E3连接酶的相互作用同时敲低该E3连接酶观察是否能逆转A蛋白对B蛋白降解的调控作用。针对不同作用角色通常有不同的结果若突变体无法促进B蛋白泛素化和降解说明A蛋白作为E3泛素连接酶直接催化B蛋白的泛素化修饰若A蛋白过表达降低B蛋白泛素化突变体无此效果说明A蛋白作为去泛素化酶通过去泛素化抑制B蛋白降解。实验设计3最后为排除A蛋白影响泛素化B蛋白与蛋白酶体的结合。高表达或者干扰A蛋白然后通过Co-IP检测检测蛋白B和蛋白酶体亚基如PSMA7的相互作用或者通过NanoBRET®技术在活细胞水平实时监测B蛋白与蛋白酶体的相互作用。若A蛋白过表达后结合能力显著增强说明A蛋白不仅促进B蛋白泛素化还能促进泛素化B蛋白被蛋白酶体识别加速降解。四、泛素化位点鉴定明确蛋白A调控蛋白B的泛素化修饰后需要进一步找到蛋白B的泛素化修饰位点。实验设计1通过生信数据库或者质谱技术预测/鉴定蛋白B的泛素化修饰位点然后对蛋白B的潜在修饰位点进行定点突变最后高表达/敲低A蛋白后借助泛素化实验检测B蛋白的泛素化水平。B蛋白泛素化修饰位点突变后B蛋白的泛素化修饰显著降低说明蛋白A通过泛素化修饰B蛋白该位点调控其降解。