小鼠滑膜细胞（滑膜成纤维）分离、培养与鉴定方案protocol

小鼠滑膜细胞滑膜成纤维分离、培养与鉴定方案一、实验材料准备1. 实验动物SPF级7~8周龄BALB/c或C57BL/6小鼠10只2. 主要试剂消化酶Ⅱ型胶原酶浓度0.1%0.5%。培养基DMEM高糖培养基添加10%FBS和1%青霉素/链霉素双抗。缓冲液无菌磷酸盐缓冲液PBS含双抗。消毒液75%乙醇。3. 主要器材无菌手术器械眼科剪、显微镊、手术刀。超净工作台、CO₂培养箱、恒温摇床、离心机、倒置显微镜。二、滑膜细胞分离步骤1. 动物处理与组织获取采用颈椎脱臼法处死小鼠随即将其整体浸入75%乙醇中浸泡消毒25分钟。将小鼠腹面向上固定用碘伏或酒精棉球消毒膝关节区域。沿膝关节正中线切开皮肤钝性分离皮下肌肉充分暴露膝盖骨及周围关节囊。仔细辨识关节囊内层光滑的滑膜组织用显微剪刀小心将滑膜层从纤维层上剥离下来注意避免夹带黄色脂肪组织即“蛋黄样”物质。可取整段关节囊不打开关节腔以利于获得更多的成纤维样滑膜细胞。2. 组织清洗与破碎将剥离的滑膜组织立即放入预冷的含双抗PBS中置于冰上。用PBS反复漂洗组织块35次直到洗液清亮无血渍。将洗净的组织置于无菌培养皿中用眼科剪将其剪成约1 mm³大小的碎块。3. 酶消化法分离细胞将剪碎的组织块转移至离心管中加入预热至37℃的Ⅳ型胶原酶消化液用量一般为组织体积的510倍。将离心管放入37℃恒温摇床以约200转/分钟的速度振荡消化60分钟。或置于37℃培养箱中静置消化连续收集消化后26小时内的细胞悬液此时间段获得的细胞数量较多。消化结束后可用涡旋振荡器短暂振荡12分钟以帮助细胞分散。4. 终止消化与细胞收集向消化液中加入等体积的含血清完全培养基终止酶反应。将细胞悬液以300400 g离心510分钟。弃去上清用完全培养基重悬细胞沉淀备用。三、原代培养与传代1. 原代接种将重悬后的细胞悬液连同可能残留的未消化组织小块接种至培养皿或T25培养瓶中。补加完全培养基至适宜体积置于37℃、5% CO₂的培养箱中静置培养。接种后第2天可见大部分细胞贴壁第3天进行首次半量换液之后每34天更换一次新鲜培养基。2. 细胞传代纯化当原代细胞生长至培养皿底面积80%90%汇合时进行传代。弃去旧培养基PBS洗涤一次加入适量胰蛋白酶-EDTA消化液室温或37℃消化至细胞变圆脱落。加入含血清培养基终止消化吹打制成单细胞悬液离心后重悬。按1:2或1:3的比例分瓶接种。注意原代培养初期会混有少量圆形、贴壁不牢的滑膜巨噬细胞A型细胞这类细胞随着传代次数增加而逐渐减少。通常传至第3代约培养1520天后即可获得形态均一、呈长梭形的滑膜成纤维细胞B型细胞纯度可达95%以上。四、滑膜细胞鉴定方法1. 形态学观察在倒置显微镜下典型滑膜成纤维细胞呈长梭形或不规则多角形贴壁生长胞质透亮核呈卵圆形。2. 免疫荧光染色推荐检测标志物选用波形蛋白Vimentin、CD90、纤维连接蛋白Fibronectin作为阳性标志物同时可检测CD68或F4/80以排除巨噬细胞污染。判定标准若Vimentin阳性细胞比例90%则认为滑膜成纤维细胞纯度合格。五、关键注意事项整个操作过程需严格无菌器械使用前应灭菌处理。剥离滑膜时尽量剔除脂肪和肌肉组织以免成纤维细胞混杂。消化酶浓度和时间需根据组织量适当调整避免过度消化损伤细胞。原代培养前3天尽量少移动培养皿以利细胞贴壁。传代不宜过稀否则细胞生长缓慢形态易发生改变。若需长期保存可在第35代时进行冻存冻存液使用90% FBS 10% DMSO或者无血清的冻存液。武汉云克隆自2009年成立以来已深耕原代细胞领域近二十年依托自有SPF级实验动物中心和标准化细胞制备平台已制备原代细胞类型涵盖软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、星形胶质细胞、上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、各种干细胞等。公司自有动物中心已获得小动物生产许可证和大、小动物使用许可证可提供多种动物来源的原代细胞。公司业务遍布全球70余个国家和地区是国内少数具备正规细胞出口资质的企业之一。此次大鼠主动脉内皮细胞产品的推出进一步完善了公司在心血管研究领域的细胞资源布局